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筛选稳定细胞株时可能出现的问题及其解决办法

点击次数:256  发布时间:2019-08-20
     外源基因在细胞中的表达可分为两大类,一类是瞬时表达,一类是稳定表达。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,虽然可以达到高水平的表达,但通常只持续几天。后者外源DNA整合到宿主细胞染色体上,使宿主细胞可长期表达目的基因。建立稳定细胞株,一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。常用的抗性标记基因有潮霉素(hygromycin)、新霉素(neomycin)和嘌呤霉素(puromycin),常用Hygromycin B、G418和puromycin进行选择性筛选。传统的稳定株筛选方法需要通过外源基因的瞬时转染后对靶细胞进行筛选,终获得从单一细胞扩增起来的稳定细胞株,该方法阳性率低,周期长,工作量大。慢病毒是一种RNA病毒,携带的外源基因在病毒感染细胞后需要逆转录为DNA,再整合到宿主细胞基因组以后才能表达。利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端,可以在短时间内获得率的稳定细胞株。筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白,用于蛋白的扩增和富集;或者得到稳定沉默特定基因的细胞株。
    筛选稳定细胞株时出现的问题及其解决办法:
    做hela细胞的筛选,现在已经筛选稳定细胞株3周,在6孔板中已经长出一些细胞簇,想把它挑到96孔板中,就用2ul胰酶消化,在消化过程中,胰酶扩散,细胞已经四散开,和周围的其它细胞簇融合在一起(我的细胞簇离的很近),就是说几个细胞簇被胰酶融合在一起,那样根本没有办法做下去了,该怎么办?
    1.可以减少胰酶量;胰酶在加入之前要用37度温箱预热,并且PBS润洗细胞层,以减少可能残存的血清的影响;
    2.加入胰酶后,稍过几秒钟就可以吸走消化液了,不用吸干净,然后放到37度温箱中继续作用1MIN,这时,消化酶可以继续作用的,又可避免胰酶扩散;
    3.显微镜下观察细胞完全松散开,就可以在局部加培养基,并被吸走了;
    4.具体消化的时间,注意摸索,如果在步骤b中显微镜下见细胞尚未完全松散开,可以再重复的,直到松散开,能够被吸走为止。
    建议:
    1.在100mm dish中挑克隆,细胞分的稀一点。
    2.把细胞全部消化下来,在96孔板中逐步稀释筛选稳定细胞株。
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