高压灭菌器将待灭菌物品放置在密封的加压灭菌罐中，并加热它们以煮沸灭菌罐隔间中的水以产生蒸汽。当蒸汽从排气阀快速排出锅内的冷空气时，关闭排气阀并继续加热。此时，高压灭菌器中的压力增加，因为蒸汽不能溢出，从而提高了沸点并获得高于100℃的温度。导致菌体蛋白凝结变性，达到杀菌的目的。
高压灭菌器在使用之前需对环境进行检测：
1、物理监测：操作人员对每次灭菌应连续监测并记录灭菌时的温度、压力和时间等灭菌参数，灭菌参数符合高压灭菌器的使用说明或操作手册的要求。
2、化学监测：每个灭菌物品包外应使用包外化学指示物，作为灭菌过程的标志;每包内难灭菌的位置放置包内化学指示卡，指示卡由棕色变绿色，表示达到灭菌条件。
3、生物监测：每灭菌批次应进行生物监测，采用枯草杆菌黑色变种芽孢进行生物监测，在灭菌周期完成后立即将生物指示剂从被灭菌物品中取出并进行培养。
除此之外，为了保证高压灭菌器使用的稳定性以及安全性，操作中的这些禁忌需要重点关注：
1、排气软管没有按要求插入灭菌筒的下部，或排气软管断裂、缺失：灭菌锅内的冷空气是通过排气软管排出的，上述情况将造成灭菌筒外的蒸汽直接经排气阀排出锅外，灭菌锅内的空气排放受阻。
2、温度不稳定：灭菌过程中温度忽高忽低，特别是手提式电能灭菌锅，它没有控温装置，难于控温。操作者可配置调压变压器，通过调节电压控温。此外，还常遇到灭菌锅内加水太少（应加2-3L）；容器内装的溶液量过多，安全阀失灵等问题。
3、任意延长灭菌时间。规定的灭菌温度和时间是经过科学试验确定的，只要按照正确的灭菌程序是能达到灭菌目的的。但在实践中常有人为了“保证*灭菌”而任意延长灭菌时间。这样忽视了杀菌过程中温度对培养基成分的破坏作用，是得不偿失的。
