高压消毒灭菌锅使用时，关键的是将锅内空气排尽。如锅内有空气，则气压针所指的压强不是饱和蒸汽产生的压强。相同的压强，混有空气的蒸汽其温度低于饱和蒸汽所产生的温度。因此*排除锅内空气使锅内全部是水蒸气，灭菌才能*。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力到所需时间。
达到灭菌时间后即可切断电源，在压力降到0.05MPa，可缓慢放出蒸气，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后才能开盖，取出培养基摆在平台上以待冷凝，不可久不放气，否则容易引起培养基成分变化以至无法制作斜面培养基。如果因为久不放气导致锅炉内产生负压、盖子打不开，可以将放气阀打开，让空气进入，内外压力平衡后盖子就可以打开了。
不能使用高压消毒灭菌锅消毒的物品有哪些？
1. 爆炸物质：乙二醇二硝酸酯(硝化甘醇)，硝化纤维素(硝化纤维素滤器)和所有含硝酸根的酯类。三硝基苯和所有易燃易爆的硝基，过氧乙酸，甲烷基，乙基，甲醇，过氧化氢，过氧化物，苯甲酰，苯甲酰基及有机过氧化物。
2. 可燃性物质：金属锂、钾、钠、黄磷、磷、硫化物。明胶、碳化钙(电石)、氧化钙(石灰)，镁粉，连二亚硫酸钠(保险粉)。
3. 氧化剂：KCL，氯化钠，氯化铵和其他氯化物。高氯酸钠和其他高氯化物(粉剂)。硝酸钾，硝酸钠和其他硝酸物。过氧化钾，过氧化钠，过氧化钡和其他无机过氧化物。亚氯酸钠和其他亚氯化物，次氯酸钙和其他次氯酸物。
4. 易燃物质：汽油，乙醛(醋醛)，氧化丙稀，环氧丙烷，二硫化碳，和其他燃点在-30℃～0℃间的物质。甲醇，乙醇，二甲苯，苄基，乙酸苄酯，和其他燃点在0℃～30℃之间的物质(醇类)。灯油，火油，异戊醇，乙酸(醋酸)，和其他燃点在30℃～65℃之间的类似物质。
